Metaboloomika tuumiklabor

Shimadzu Prominence – QTRAP 3200

Robustne ja mitmekülgne süsteem erinevate kromatograafiliste eraldamiste ning massspektromeetriliste skäneerimisvõimalustega (vt loetelu allpool). Kuigi QTRAP 3200 on vanem ning vähemtundlikum mudel kui QTRAP 4500, on tal foto- ja nanopihustus ionisatsiooniallikad lisaks tavapärastele Turbo V elektropihustusele. See võimaldab nii fotoionisatsiooni kui alla mikroliitristekoguste analüüsimist. Kromatograafia süsteemi saab täiendada fluorestsentsdetektoriga võimaldades samaaegselt massi spektrile tuvastada ka fluorestseeruvaid aineid.

Kromatograafia protokollid

Esiteks on võimalik otsene infusioon, ehk kromatograafi pumpasid ja süstimisseadet või spetsiifilist süstalt kasutatkse elundi ja proovi viimiseks mass-spektromeetrisse, kuid kromatograafia kolonni süsteemi ei ühendata ning ainete eraldamist seetõttu ei toimu. Et tegu on väga kiire analüüsiga – vaid kuni viis minutit proovi kohta – on see tihti eelistatud kui ökonoomseim meetod. Keeruliste segude, kõrge soola või muu kergeltioniseeruva aine juuresolekul või ka määratavate ainete väga madalatel kontsentratsioonidel võib aga otsene infusioon mitterahuldavaid tulemusi anda ning abi võib olla kromatograafilisest lahutamisest.

C18 analüütilised kolonnid on esmavalik juhtudel, kus ainete üksteisest lahutamine on vajalik. HILIC on teine sagedamini kasutust leidev kolonnitüüp. Analüüsiaeg tõuseb kolonniga 30-60 min peale ühe proovi kohta. Tuumiklabor eelistab kasutada omi kolonne, kui soovite kasutada isiklikku või mõnda väga spetsiifilist kolonni, siis palun kontakteeruge personaliga.

Mass spektromeetria skänneeringud

• Enhanced mass spectrum (EMS) – mass-spekter selle sõna tavapärases tähenduses, ehk m/z 50-1500 vahemiku intensiivsuste jaotus.
• Fragmentatsioonanalüüs – vajalik molekulide identifitseerimiseks ning eellasioonide ning MRM skänneeringute metoodikate ülesehitamiseks.
• Multiple reaction monitoring (MRM) – kasutab eelasiooni ning ühe fragmendi m/z väärtusi, et spetsiifiliselt vaadata vaid sellise kombinatsiooniga aineid proovis. Üks analüüs võib sisaldada paljusid ioonpaare võimaldades mitmete ainete samaaegset mõõtmist. Et keskendutakse vaid üksikutele ainetele on tegu spetsiifiliseima ja tundlikuima analüüsitüübiga, muutes ta soovitud variandiks kvantitatiivsetel analüüsidel.
• Eelasiooni skänneering – kasutades fragmendi m/z väärtust otsitakse kõiki aineid, mis antud fragmenti sisaldavad. Võib sobida biotransformatsiooni uuringuteks või ka sarnast struktuuri sisaldavate aineklasside (näiteks atsüülkarnitiinid) analüüsiks.
• Kõrgendatud resolutsioon (Enhanced resolution) – Kuigi QTRAPid on niinimetatud “madala resolutsiooniga” mass- spektromeetrid, võimaldab see skänneering näha kitsast piirkonda kõrgema lahutuvusega kui tavaline EMS skänneering. Kasulik, kui on tarvis täpsemalt hinnata isotoopide jaotust näiteks aine identiteedi määramisel.

Agilent 1200 - QTRAP 4500

Tundlikum kui QTRAP 3200 ning proovi sisestusel saab kasutada erinevaid 96-384 augulisi plaate. Samuti ühilduv kommertsiaalsete kittidega nagu BioCratese AbsoluteIDQ p180. 

Kromatograafia protokollid

Esiteks on võimalik otsene infusioon, ehk kromatograafi pumpasid ja süstimisseadet või spetsiifilist süstalt kasutatkse elundi ja proovi viimiseks mass-spektromeetrisse, kuid kromatograafia kolonni süsteemi ei ühendata ning ainete eraldamist seetõttu ei toimu. Et tegu on väga kiire analüüsiga – vaid kuni viis minutit proovi kohta – on see tihti eelistatud kui ökonoomseim meetod. Keeruliste segude, kõrge soola või muu kergeltioniseeruva aine juuresolekul või ka määratavate ainete väga madalatel kontsentratsioonidel võib aga otsene infusioon mitterahuldavaid tulemusi anda ning abi võib olla kromatograafilisest lahutamisest.

C18 analüütilised kolonnid on esmavalik juhtudel, kus ainete üksteisest lahutamine on vajalik. HILIC on teine sagedamini kasutust leidev kolonnitüüp. Analüüsiaeg tõuseb kolonniga 30-60 min peale ühe proovi kohta. Tuumiklabor eelistab kasutada omi kolonne, kui soovite kasutada isiklikku või mõnda väga spetsiifilist kolonni, siis palun kontakteeruge personaliga.

Mass spektromeetria skänneeringud

• Enhanced mass spectrum (EMS) – mass-spekter selle sõna tavapärases tähenduses, ehk m/z 50-1500 vahemiku intensiivsuste jaotus.
• Fragmentatsioonanalüüs – vajalik molekulide identifitseerimiseks ning eellasioonide ning MRM skänneeringute metoodikate ülesehitamiseks.
• Multiple reaction monitoring (MRM) – kasutab eelasiooni ning ühe fragmendi m/z väärtusi, et spetsiifiliselt vaadata vaid sellise kombinatsiooniga aineid proovis. Üks analüüs võib sisaldada paljusid ioonpaare võimaldades mitmete ainete samaaegset mõõtmist. Et keskendutakse vaid üksikutele ainetele on tegu spetsiifiliseima ja tundlikuima analüüsitüübiga, muutes ta soovitud variandiks kvantitatiivsetel analüüsidel.
• Eelasiooni skänneering – kasutades fragmendi m/z väärtust otsitakse kõiki aineid, mis antud fragmenti sisaldavad. Võib sobida biotransformatsiooni uuringuteks või ka sarnast struktuuri sisaldavate aineklasside (näiteks atsüülkarnitiinid) analüüsiks.
• Kõrgendatud resolutsioon (Enhanced resolution) – Kuigi QTRAPid on niinimetatud “madala resolutsiooniga” mass- spektromeetrid, võimaldab see skänneering näha kitsast piirkonda kõrgema lahutuvusega kui tavaline EMS skänneering. Kasulik, kui on tarvis täpsemalt hinnata isotoopide jaotust näiteks aine identiteedi määramisel.

Nõuded proovile

Põhiline nõue proovile on, et määratav aine oleks lahuses. Tahked ained ning suspensioonid ei sobi kasutatavate ionisatsioonimeetoditega. Lahustiks võib olla nii vesi kui orgaaniline solvent. Kui proov on lahuses, siis on teisejärguline kas algselt oli tegu vere, luu, naha, puukoore või millegi muuga. Vere proovidest eelistame plasmat seerumile, kuid üldiselt pole ka viimane vastunäidustatud. Me ei mõõda radioaktiivseid proove ega proove, mis vajavad erikäitlemist (näiteks eluvõimelisi viiruseid sisaldavad). Vajadusel võib tuumiklabori personal abistada proovide ettevalmistamisel, kuigi enamasti arvestame, et põhiliselt on see kasutajate endi teha. Vajaminev proovi kogus sõltub analüüsidest, aga reeglina 50-200 mikroliitrit on piisav.

Analüüside tüübid

Globaalne profiil ehk “suunamata” analüüs annab üldise massi spektri (ning vajadusel kromatogrammi) proovist. Tüüpiline eesmärk profiilidel on leida proovide vahel erinevusi. Andmetöötlus võib taanduda ANOVA peale, kuid enamasti eelistatakse peakomponent ja vähimruutude regresioon või diskriminantanalüüse. Globaalne profiil üritab näha võimalikult palju ja võimalikult üldist pilti proovist, ja selgitada, kas see üldpilt või muster annab alust kahtlustada olulist erinevust metaboliitide koosluses. Ühest küljest tähendab selline üldine vaatamine, et ei ole vaja eelnevalt teada, mis aineid otsitakse. Teisest küljest, juhul kui muutusi leitakse, võib tekkida probleem muutusi põhjustavate ainete identifitseerimisega. Selline identifitseerimine võib, aga ei pruugi õnnestuda ning nõuab alati täiendavaid analüüse.

Kindla aine kvalitatiivne analüüs. Kui proovis eeldatakse olevat kõrges kontsentratsioonis uuritavat ainet (nt. keemilise sünteesi produkt), siis lihtne EMS analüüs võib olla piisav, et kinnitada eeldatava aine olemasolu proovis. Kui uuritavat ainet on vähe (näiteks ravim sihtmärkkoes), siis võib olla vajalik keerulisemate ning kromatograafilist lahutamist sisaldavate protokollide kasutamine. Aine identsuse kinnitamiseks on hea kui kontrolliks on olemas õige aine puhtal kujul ning uuritavat proovi saab võrrelda teadaoleva prooviga.

Kindla aine kvantitatiivne analüüs. Kvantifitseerimine nõuab sisemisi ja väliseid standardeid, tõstes märkimisväärselt nii analüüsidele kuluvat aega kui hinda. Ideaalne sisestandard on (mitteradioaktiivsete) isotoopidega märgistatud, kuid looduslike isotoopidega mittekattuva massiga, sama aine. Isotoopmärked on paraku saadaval vaid osadele ainetele ning nende hind on kõrge. Ideaalse sisestandardi puudumist saab asendada mõne teise sisestandardi ning väliste standarditega, kuid oht saada süstemaatiline viga suureneb sellegi poolest. Viimane pole reeglina probleem kui eesmärgiks on võrrelda kontsentratsioone suhteliselt sarnase koostisega provides ühe uuringu piires.

Kvantitatiivsed analüüsid kommertsiaalsete kittidega. Tuumiklaboril on kogemusi BioCratese AbsoluteIDQ p180 kitiga, mille analüüs toimub 96 augu plaadis ehk umbes 80 proovi korraga. Kiti maksumus tuleb katta analüüsi tellijal. Teiste kommertsiaalsete kittide kasutamise soovidel palume kontakteeruda personaliga, et täpsustada meie riistvara sobivust vastavateks analüüsideks.

Hind

Uuringute maksumuse katmiseks on kaks võimalust.

• Esimene on lähtuvalt alltoodud hinnakirjast. Siiski, meie personal ning aparatuuri kasutusaeg on piiratud ning sõltuvalt teistest käimasolevatest mõõtmistest ei pruugi olla võimalik täita kõiki tellimusi koheselt. Seetõttu palume kõigepealt personaliga ajastus läbi rääkida enne kui proovid valmis teha.
• Teine võimalus uuringute teostamiseks on teaduslik koostöö. Sõltuvalt projektist võib tuumiklabor olla ka teaduspartneriks. Sel juhul katame osaliselt või täielikult metaboloomika analüüside kulud ise, kuid eeldame kaastatust eksperimentide disaini, andmetöötlusesse, tulemuste tõlgendamisse ning avaldamisse.

Väljaõpe

Üldiselt me ei tee väljaõpet mass-spektromeetrite käsitlemiseks, sest ei pea kulutõhusaks koolitada kasutajaid, kes igapäevaselt antud vallas ei tegutse. Siiski, personaalne õpe on võimalik pikemate projektide ja koostööde raames.